La diagnostica di laboratorio: stato dell’arte e prospettive future
Matteo Gastaldi
Unità di ricerca di Neuroimmunologia, Istituto Neurologico Nazionale a Carattere Scientifico-IRCCS Fondazione C. Mondino, Pavia
La determinazione di specifici autoanticorpi è cruciale nell’iter diagnostico della miastenia grave (MG), patologia autoimmune della giunzione neuromuscolare, e dei disordini dello spettro della neuromielite ottica (NMOSD), astrocitopatie autoimmuni. L’accuratezza diagnostica impatta anche nello scenario terapeutico. In MG, l’identificazione di anticorpi anti-recettore nicotinico dell’acetilcolina (AChR Abs), principale sottoclasse IgG1, orienta il trattamento verso l’uso di farmaci inibenti la cascata del complemento nei casi che non rispondono alle immunoterapie convenzionali, mentre nelle forme associate ad anticorpi anti-chinasi muscolo specifica (MuSK), principale sottoclasse IgG4, sono indicati farmaci depletanti i linfociti B (1). In NMOSD, gli anticorpi patogenetici diretti contro il canale dell’acquaporina-4 (AQP4) sono anch’essi di sottoclasse IgG1, con risvolti terapeutici analoghi a quelli sopracitati per MG AChR Ab-mediata (2). Non meno importante, gli AQP4 Abs permettono, con elevatissima specificità, la distinzione tra NMOSD, sclerosi multipla e disordini associati ad anticorpi anti-glicoproteina associata alla mielina (MOGAD), orientando le strategie terapeutiche.
L’identificazione di autoanticorpi in MG e NMOSD è pertanto di grande rilevo e richiede l’utilizzo di metodiche dotate di elevata accuratezza. Il gold standard per l’identificazione di AChR Abs è il test di radioimmunoprecipitazione (RIPA). È un test in fase solubile, basato sull’estrazione dell’AChR da linee cellulari, con successiva marcatura mediante bungarotossina radiomarcata. La misurazione della radioattività permette di quantificare l’autoanticorpo presente nel siero del soggetto. Questo test ha specificità elevatissima, vicina al 100%. Il RIPA è da anni considerato anche gold standard per l’identificazione di MUSK Abs. Uno svantaggio del RIPA è l’impiego di isotopi radioattivi, con relativi problemi di smaltimento, svantaggio che sta drasticamente riducendo, in generale, il numero di RIPA usati nei laboratori di analisi. Nel caso di AChR e MuSK Abs, per far fronte al problema sono stati introdotti di recente test basati su linee cellulari immortalizzate (cell-based assay; CBA) (3). Il vantaggio principale è che le cellule, mediante procedura di trasfezione, possono iperesprimere l’antigene target sulle membrane plasmatiche, con conformazione del tutto simile a quella riscontrabile in vivo. Ciò consente di identificare anche anticorpi diretti contro epitopi che dipendono dalla conformazione terziaria della proteina target (anticorpi conformazionali). I CBA possono usare cellule vive, con mantenimento della proteina nel suo stato nativo, ma con difficoltà esecutive, data la necessità di facilities per colture cellulari, e per oggettivi problemi di standardizzazione. In alternativa, i CBA sono trattati con agenti fissanti, rendendone possibile commercializzazione e uso in laboratori generalisti. Di rilevanza, nei confronti dei corrispettivi RIPA, i CBA permettono di identificare AChR Abs in una quota variabile (fino al 40%) di pazienti “doppi sieronegativi” (4). Sono le positività dirette contro l’AChR cosiddetto “clusterizzato”, rappresentato cioè da diverse molecole raggruppate. I CBA sembrano inoltre essere più sensibili del RIPA anche nell’identificazione di MuSK Abs. È di recente commercializzazione un CBA per la detezione contemporanea di AChR e MuSK Abs. Le performance del CBA sembrano essere ottime, con specificità paragonabile al RIPA, e vantaggi in sensibilità dati dall’identificazione di casi “doppi sieronegativi”. Infine, ELISA sono disponibili in commercio per i dosaggi di AChR e MuSK Abs, ma le performance globalmente peggiori rispetto a RIPA e CBA tendono a non raccomandarne l’utilizzo.
Per quanto riguarda gli AQP4 Abs, la loro natura fortemente conformazionale ha portato all’utilizzo del CBA come test di prima scelta (5). Diversi studi hanno dimostrato la superiorità del CBA rispetto ad altri test disponibili, quali l’ELISA e il RIPA, e il suo utilizzo è fortemente raccomandato per una diagnosi accurata. Come per gli AChR Abs, il test può essere effettuato su cellule sia vive, sia fissate, sulle quali si basano i kit commerciali. La concordanza tra i due CBA è molto elevata, con minimo vantaggio in sensibilità del test a cellule vive (5).
Nel panorama Italiano della diagnostica di laboratorio di MG e NMOSD, falsi positivi e falsi negativi sono comuni, come si evince dai risultati dei controlli esterni di qualità promossi dall’Associazione Italiana di Neuroimmunologia (AINI) e dalla Rete degli IRCCS di Neuroscienze e Riabilitazione (RIN) (6). I motivi dell’inaccuratezza analitica sono vari. In primo luogo, alcuni laboratori utilizzano test di semplice esecuzione, come per esempio gli ELISA, al posto dei gold standard raccomandati. In secondo luogo, alcuni test anticorpali, e in particolare i CBA, sono di difficile interpretazione, soprattutto se l’esperienza del laboratorio generalista con questo tipo di metodiche è limitata; all’operatore è infatti richiesto expertise per specifici pattern da riconoscere in microscopia a fluorescenza. Per superare queste oggettive limitazioni, e per estendere a tutto il territorio nazionale una diagnostica di secondo livello, il Network Italiano per lo studio della Neurologia Autoimmune (NINA), sotto l’egida di AINI e RIN, ha sviluppato un progetto sperimentale (NINA-flow), che prevede l’implementazione di flussi di campioni tra neurologie italiane e laboratori di primo e secondo livello (per dettagli, Franciotta D., ibidem). Questo modello, che non ha precedenti in Europa, avrà importanti ricadute sia per i pazienti, ai quali garantirà un percorso diagnostico efficiente, sia per i laboratori, che potranno sfruttare questa occasione per migliorare le performance analitiche. Infine, i dati raccolti forniranno la base per ulteriori studi di standardizzazione in questo settore.
Con il contributo non condizionante di 
Riferimenti bibliografici
Cao M, Koneczny I, Vincent A. Myasthenia Gravis With Antibodies Against Muscle Specific Kinase: An Update on Clinical Features, Pathophysiology and Treatment. Front Mol Neurosci. 2020 Sep 2;13:159.
Jarius S, Wildemann B. AQP4 antibodies in neuromyelitis optica: diagnostic and pathogenetic relevance. Nat Rev Neurol 2010;6:383-92.
Gastaldi M, Scaranzin S, Businaro P, Mobilia E, Benedetti L, Pesce G, Franciotta D. Improving laboratory diagnostics in myasthenia gravis. Expert Rev Mol Diagn 2021;21:579-90.
Cruz PMR, Al-Hajjar M, Huda S, Jacobson L, Woodhall M, Jayawant S, et al. Clinical Features and Diagnostic Usefulness of Antibodies to Clustered Acetylcholine Receptors in the Diagnosis of Seronegative Myasthenia Gravis. JAMA Neurol. 2015;72(6):642–649.
Waters P, Reindl M, Saiz A, Schanda K, Tuller F, Kral V, et al. Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2016 Sep;87(9):1005-15.
Gastaldi M, Zardini E, Scaranzin S, Uccelli A, Andreetta F, Baggi F, Franciotta D. Autoantibody Diagnostics in Neuroimmunology: Experience From the 2018 Italian Neuroimmunology Association External Quality Assessment Program. Front Neurol. 2020;10:1385.
